Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

У пробірці експерименти

Міобластів трансфіковані з різними умовами 2'OMePS лікування для того, щоб порівняти ефективність кожного AON. Поодинокі процедури AON з 600 нМ кожного з Ex6A, Ex6B, Ex8A або Ex8B були зроблені, а також лікування коктейль з 600 нМ кожного з усіх 4 AON послідовностей. Зразки РНК збирали через чотири дні після трансфекції. Після того, як RT-PCR, зразки для кожної обробки були проведені на гелі разом з необробленими (NT) зразків. Смуги вище на гелі вдають із власного кадру продуктів DMD; ці смуги були помічені в NT, Ex8A і Ex8B лікування міобластів. Ex6A, Ex6B, Ex8A, і коктейль оброблених міобласти показали в кадрі продукти. Коктейль і Ex6A / B показав 100% в рамці продуктів, в той час як Ex8A показав тільки 30% в рамці вироби (малюнок 7). Для підтвердження пропуску екзона і восстановленіерамка зчитування, кДНК послідовність була виконана; Результати показали, що Екзони 6 - 9 дійсно був пропущений (малюнок 7). Імуногістохімія показали, що AON лікування собак збільшилася дистрофина-позитивних волокон в порівнянні із зразками NT (рисунок 8).

In Vivo експерименти

Для порівняння ефективності різних умов обробки AON, CXMD собаки (0,5 - 5 років) вводили одноразово 1,2 мг Ex6A або коктейль з Ex6A, Ex6B і Ex8A при різних дозуваннях. Через два тижні після ін'єкції, зразки м'язів були зібрані і фарбували DYS-1 для порівняння кількості дистрофина-позитивних волокон. Все коктейль оброблені зразки показали підвищену експресію дистрофина в порівнянні із зразками NT. Дистрофин-позитивних волокон збільшилася з дозуванням AON (малюнок 9). Після сістемиIC ін'єкції, дикого типу (WT), NT, а також коктейль-оброблених зразків CXMD м'язів фарбували DYS-1 (рисунок 10). Коктейль оброблених CXMD собак показали підвищену експресію дистрофина в порівнянні з NT CXMD собак, як в КТ і зразки серцевого м'яза. Проте, AON оброблених скелетних м'язів (КТ) показали значно вищу експресію дистрофина в порівнянні з обробленою серцевого м'яза. Імуноблот порівняння WT, NT, а також різні морфоліно коктейль оброблених м'язів призвело до такого ж висновку. Був також великий діапазон експресії дистрофина в оброблених зразках скелетних м'язів (Малюнок 10). Гематоксиліном і еозином фарбування (ОН) показало, що лікування CXMD Собаки показали поліпшену гістопатології, зі значним зменшенням центрально структуроутворювача волокон (УТС) в порівнянні з НТ CXMD собак (рисунок 11). Це вказує на те є більше дегенерації / регенерації відбувається у собаки NT, знак дистрофічні м'язової патології. Крім того, лікування собак були бистрееработает раз і поліпшені оцінки по клінічної шкалою оцінок. Оброблені собаки CXMD показали кращі результати, ніж NT CXMD собак у всіх категоріях (рисунок 12).

Малюнок 1
Малюнок 1. Структура Мутація в CXMD Собака і екзонів 6 - 8. Пропуск стратегій з використанням антисмислового коктейль CXMD собаки мають точкова мутація в екзоні 6 призводить до втрати екзона 7 в мРНК дистрофічних собак. Це призводить до мРНК бути поза кадром і виробництва дистрофина втрачається. Короткі послідовності AON призначені для зв'язування з екзонів 6 і 8, що призводить до сплайсингу мРНК ефективно скачущей екзонів 6 - 8. Сіра смуга в коктейлі оброблених собак AON представляє короткі послідовності AON. Екзон 9 кодує шарнірний домен і іноді мимоволі зрощені з AONs проти екзона 6 і 8. Отримані в результаті коди мРНК дистрофина білки, які коротше, але функциии ін. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 2
Малюнок 2. Основні клінічні симптоми 1-річний Собачий Х-хромосомою м'язової дистрофії (CXMD) тварини. А 1-річний дикого типу Бігль і CXMD собаки показані. Участь проксимальної, кінцівки, і скроневої м'язи, як правило, спостерігається з 2-місячного віку. Спільне контрактури і зміщення тазу є відверте від 4-х місячного віку. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 3
Малюнок 3. Загальний наркоз для собаки. А) IntramusculА.Р. ін'єкції і м'язові біопсії проводиться під загальним наркозом з ізофлуран. Б) Проведення тваринного для системних ін'єкцій. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 4
Малюнок 4. Магнітно - резонансна томографія (МРТ) дикого типу, Необроблені CXMD і обробили CXMD. МРТ задньої кінцівки через 3 місяці і 5 місяців в WT і NT CXMD собак. Два зразка зображення, оброблених CXMD задніх кінцівок MRIS pre- (за 1 тиждень до першої ін'єкції) і після ін'єкції AON показані. 2703MA обробляли 7x щотижня з 200 мг / кг коктейль Morpholinos. 2001MA обробляли 5-кратним тижневої внутрішньовенної ін'єкції 120 мг / кг коктейль Morpholinos. Контроль і лікування собаки були підібрані за віком. Оброблені собаки показують зменшилися Т2 сигнали. Зображення УРАФ Тед з дозволу Йокота і ін. (Авторське право 2009 John Wiley & Sons) 40 Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 5
Малюнок 5. біопсію м'язи Процедура собаки. А) нижніх кінцівок фіксується для біопсії м'язів. Б) За допомогою пінцета, нижня кінцівку утримується. C) м'язи CT піддається впливу. Метод відкритої біопсії використовується для отримання зразків м'язових закачаного сайтів. Нитки використовуються для зберігання зразки біопсії. Зразки D) М'язові на трагакант після розтину. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

/53776/53776fig6.jpg "/>
Малюнок 6. напівсухий спосіб передачі. Подання напівсухого способу перенесення для Вестерн - блоттинга представлена. Три роботи замочують в концентрованому буфері анода укладають на негативному терміналі; 3 паперу, змочені в анодної буфері покладені на вершині цього. Папір Мб ПВДФ замочують в метанолі, а потім анодної буфера перед тим, як укладають поверх 6 паперів. Гель, який був замочують в катодному буфері, укладають обережно через PVDF папір. І, нарешті, 3 паперу, просочені в катодному буфері укладають поверх гелю. Позитивний висновок встановлюється на вершині. Протягом 1 ч, 400 мА проходить через систему. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 7
Малюнок 7. Пропуск екзонів в CXMD міобластів. > CXMD міобластів трансфіковані Ex6A, Ex6B, Ex8A, або поодинці Ex8B, або коктейль з усіх чотирьох. В цілому 600 нм використовували для окремих послідовностей і для коктейлю використовували 600 нМ кожної послідовності. А) 2'OMePS лікування в міобластів собак CXMD. Ex6A, Ex6B, і коктейль оброблені зразки показують сильні смуги при очікуваній позиції в рамці зчитування екзона-пропускаються транскриптов. Ex8A показує проміжну смуга, Ex8B показує слабку смугу, і НТ не вказує смугу в положенні, в рамці зчитування. B) кДНК послідовності з однієї тільки Ex6A, через 4 дні після трансфекції. Зображення виконані з дозволу Йокоте і ін. (Copyright 2009, John Wiley & Sons) 40. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 8
Малюнок 8. Збільшення Dystrop хін Експресія в 2'O-метилованих фосфотіоатних (2'OMePS) трансфіковані CXMD міобластів. CXMD міобластів трансфіковані тільки Ex6A або коктейль 2'OMePS. DYS-2 (червоний) і (синій) фарбування DAPI, показані. Оброблені міобласти порівнюють з диким типом (WT) і необробленими (NT) міобластів. Зображення виконані з дозволу Йокота і ін. (Авторське право 2009 John Wiley & Sons) 40. Bar = 50 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 9
Малюнок 9. Порятунок дистрофина експресії з внутрішньом'язових ін'єкціях з Morpholinos поодинці CXMD Собаки. Або Ex6A або коктейль з Ex6A, Ex6B і Ex8A вводили в м'язи КТ CXMD собак. Дистрофина (DSY-1) Фарбування дикого типу (WT), необроблений (НТ), і оброблені собаки CXMD показані. Собаки були або оброблені тільки 1,2 мг Ex6A або 1,2 мг коктейлем. Зображення виконані з дозволу Йокота і ін. (Авторське право 2009 John Wiley & Sons) 40. Bar = 100 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 10
Малюнок 10. Збільшення дистрофина Expression Після Системної Коктейль морфоліно Лікування в CXMD собак. Дистрофина (DYS-1) фарбування використовували для порівняння експресії дистрофина в дикого типу (WT) (позитивний контроль), необроблений (NT) (негативний контроль), і CXMD собак, які отримували 120 мг / кг морфоліно коктейль (40 мг / кг кожного AON ). Морфоліно коктейль містив Ex6A, Ex6B і Ex8A. Собаки внутрішньовенно вводили 5 разів, миekly з цим коктейлем. A) Порівняння експресії дистрофина в черепних великогомілкової (КТ) м'язів WT, NT, і лікування собак. B) Порівняння експресії дистрофина в серцевої тканини між NT і морфоліно коктейль лікування собак. C) імуноблот для дистрофина з десмина в якості контролю навантаження показаний для WT, NT, і морфоліно коктейль лікування собак. Наступні м'язи показані для оброблених собак: триголовий м'язи плеча (ТБ), двоголового м'яза плеча (BB), діафрагма (АСВ), стравохід (ESO), CT, аддуктор (ADD), розгинач великого пальця (EDL), жувальні (MAS), і серце. Зображення виконані з дозволу Йокота і ін. (Авторське право 2009 John Wiley & Sons) 40. Bar = 200 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

фігура 11
фігура 11. Поліпшення ГИСТОПАТОЛОГИЯ в CXMD Собаки Оброблені протягом 7 тижнів з 240 мг / кг морфоліно коктейль. CXMD собак, починаючи від півроку до п'яти років внутрішньовенно вводили 240 мг / кг морфоліно коктейль (Ex6A, Ex6B і Ex8A) один раз на тиждень протягом 7 тижнів. Через чотирнадцять днів після останньої ін'єкції, були взяті стравохід м'язи і гематоксиліном і еозином фарбування (ОН) було зроблено. HE фарбування м'язів стравоходу з необробленої (NT) і морфоліно коктейль оброблений (Оброблені) CXMD собаки (40X об'єктив). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 12
Малюнок 12. Поліпшені результати по клінічну класифікацію та 15 м Час виконання Після Morpholino лікування. Morpholino лікування собак порівнювали з необробленими (NT) однопометніцаs. Стовпчики помилок в графіку показують SEM. А) Загальний бал по клінічної класифікації іспиту була розрахована до і після лікування і оброблених тварин порівнювали з однопометние NT. B) Порівняння 15 м погонних раз оброблених і NT собак. С) По аналогії з B; Проте, були використані молоді собаки. Зображення виконані з дозволу Йокоте і ін. (Copyright 2009, John Wiley & Sons) 40. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

антисмислової олигонуклеотиднуклеотидних послідовність

Ex6A GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG Ex6B ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT Ex8A CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC

Таблиця 1. антисмислової олигонуклеотид Design.